病毒转基因技术原理_范雄林　主编_9787030430649

　　《病毒转基因技术原理》由来自全国8所高等院校和科研院所的专家学者合作编写完成。重点介绍了常用病毒的转基因技术原理、纯化制备技术和医学应用现状。力图结合对病毒基本生物学特性和新进展的介绍，讲透病毒转基因技术的基本问题，突出各种不同系统的优点，探讨了存在的问题和发展趋势。

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　　第一章转基因技术概述
　　在自然界，生命的种类繁多且复杂。尽管生命的遗传性状在不同种类或同种不同个体间是有差异的，但相对稳定。在特定的条件下，遗传性状可因突变、基因转移（genetransfer）等而发生不同程度的改变。基因转移现象在自然界的生物体中非常常见。在原核细胞型微生物，基因的转移常采用转化、接合、转导、溶源性转换和原生质体融合等方式进行，可赋予受体生物新的生物学性状，如形态结构、耐药性、毒力和抗原性等的改变。而在非细胞型微生物，如病毒，可发生病毒基因组之间的重组和重配，或基因产物的互补和表型混合等；此外，部分肿瘤相关病毒的基因组可以整合到病毒感染的宿主细胞染色体中，造成宿主细胞基因组发生变异，甚至恶性转化。转基因技术，就是基于自然界中常见的基因转移现象，人为地加以利用，用于不同生命体之间基因转移，尤其是将外源基因转移入真核细胞，用以研究生命科学的基本现象和机制、基因工程产品制备、基因治疗、疾病预防和动物模型制备等，为人类的健康事业做出贡献。
　　一、常见的基因转移方式
　　（一）转化
　　早在1928年，Frederick在研究肺炎链球菌时，昀先报道了细菌的转化（transformation）现象。将有荚膜的、菌落呈光滑（S）型的Ⅲ型肺炎链球菌注射至小鼠体内，小鼠死亡，从死鼠血中可分离到Ⅲ型肺炎链球菌。将无荚膜的、菌落呈粗糙（R）型的Ⅱ型肺炎链球菌，或将ⅢS型菌加热杀死后再注射小鼠，则小鼠存活。但如将热杀死的ⅢS型菌与活的ⅡR型菌混合在一起注射小鼠，则小鼠死亡，并从死鼠血中分离出活的ⅢS型菌。这表明活的ⅡR型菌从死的ⅢS型菌中获得了产生ⅢS型菌荚膜的遗传物质，使活的ⅡR型菌转化为ⅢS型菌。1944年，Avery等用提取的ⅢS型菌的DNA片段代替热杀死的ⅢS型菌，与活的ⅡR型菌一起注射小鼠，仍导致小鼠死亡，且从死鼠血中分离到ⅢS型菌。终于证实引起ⅡR型菌转化的物质是ⅢS型菌的DNA。这就是著名的小鼠体内肺炎链球菌的转化实验。
　　现在，转化因此而被定义为：受体菌直接摄取供体菌游离的DNA片段，并将其整合到自己菌体基因中去，从而使受体菌获得供体菌新的遗传性状的过程。转化可以分为自然转化和人工转化两种。自然转化强调的是细菌只要处于感受态（competence）这一特殊的生理状态，即可摄取外源的线性染色体DNA分子和质粒。感受态的出现时间和持续时间因菌种而异。除肺炎链球菌外，其他细菌如流感嗜血杆菌、葡萄球菌和芽孢杆菌等均具有自然转化的能力。人工转化则是通过人为的方法，如低温CaCl2法诱导细菌处于感受态，使细菌具有摄取DNA的能力，或电穿孔法人为地将DNA导入菌体内，为不具有自然转化能力的很多细菌提供了一条获取外源DNA的途径，并且也是目前基因工程的基础技术之一。
　　（二）转导
　　1951年，Joshua和Norton发现了噬菌体介导的基因转移方式——转导（transduction）。用两株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌混合培养后，基本培养基上长出原养型菌落，证实了该菌中存在重组现象。继续用Davis的“U”形管实验证实这一过程是否需要细胞间的直接接触。“U”形管中间隔有滤板，只允许培养基通过而细菌不能通过。其两臂装入完全培养基，将两株营养缺陷型菌株分别接种到“U”形管两臂进行培养后，在供体和受体细菌不接触的情况下，同样出现原养型细菌。表明这一重组过程并不需要细菌的直接接触。仔细检查后发现所用的沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌，另一株是非溶源性细菌，因此可透过“U”形管滤板的应该是P22噬菌体并进行着基因的传递。
　　现在，转导被定义为以温和噬菌体为媒介，将供体菌的DNA片段转移到受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状的过程。转导在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均可发生。依据噬菌体和宿主菌关系，可把噬菌体分为毒性噬菌体和温和噬菌体。只有温和噬菌体能介导细菌的转导。根据DNA片段涉及的范围，转导可分为普遍性转导和局限性转导两种。普遍性转导是指噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体菌中；而局限性转导是指噬菌体只能携带前噬菌体整合在染色体两侧的基因片段到受体菌中。
　　（三）转染
　　通常，感染（infection）被定义为病原体通过自然的途径进入动物或人体，突破宿主的防御机制并引起不同程度的病理过程。在感染涉及的病原体中，病毒是非常具有特征性的一类病原体，属于非细胞型微生物，在自然界的分布非常广泛，可在人、动物、植物、昆虫、真菌和原核细胞型微生物中寄居并引起感染。病毒体积微小，结构非常简单，仅含一种类型的核酸，因此必须在活细胞内寄生以完成其复制周期。利用病毒专一性活细胞寄生及部分病毒整合感染的特点，对病毒的基因组进行分子遗传学改造，设计出基因工程病毒载体。这种利用病毒载体将外源基因转移入真核细胞的过程称转染（transfection），以便与病毒的自然感染过程相区别（图1-1）。近年来，转染的广义概念是指外源基因通过非病毒载体转基因技术（物理、化学方法）或病毒载体转基因技术的方法进入真核细胞的过程。
　　二、基因转移入真核细胞的方法
　　（一）基因转移入真核细胞的影响因素
　　原核生物如细菌，为了防止外源DNA的入侵，其体内的限制性内切核酸酶会将外源DNA水解成不同的片段，而同时对自己的核酸相应的酶切位点进行甲基化修饰，保护自己的基因不受自己酶的破坏，这就是细菌的限制-修饰系统（restriction-modificationsystem）。如果是质粒参与的基因转移，依据质粒复制时对宿主的依赖程度，可分为窄宿主谱质粒和宽宿主谱质粒；两种以上的质粒在同一宿主中还存在相容性和不相容性的
　　图1-1野生型病毒的自然感染、病毒载体转染和质粒经化学法介导的转染
　　问题，这些因素会影响质粒在宿主菌中的稳定性。外源基因进入受体菌，必须依赖RecA蛋白与受体细菌同源序列之间发生同源重组；或不依赖RecA蛋白和同源序列发生非同源重组，从而让受体菌获得新的遗传性状。
　　外源基因进入真核细胞的影响因素与上述原核生物有显著差别。真核细胞具有不同的膜样结构，如细胞膜将细胞与外环境隔离开来，只允许特定的物质进行膜内外的交换；细胞核膜将细胞核和细胞内环境隔离开来；细胞器膜将细胞内环境的不同功能空间隔离开来。因为外源基因的化学性质是DNA，为大分子质量的物质，并且对核酸酶非常敏感。外源基因进入真核细胞，要突破三大障碍因素。首先是必须到达细胞膜的表面，其次是如何突破细胞膜进入细胞质，昀后是如何进入细胞核并启动外源基因的表达。理想的转基因技术方法必然包括以下几个方面：能够保护外源基因不被核酸酶降解、能输送外源基因到达细胞膜表面、有利于外源基因跨过细胞膜并促进其进入细胞核。
　　（二）外源基因转移入真核细胞的类型和方法
　　外源基因进入真核细胞的类型包括质粒型载体和病毒颗粒型载体两类，后者即病毒介导的转基因技术，可分为假型病毒载体和重组型病毒载体两种。
　　质粒型载体是将外源基因克隆入含有真核细胞（病毒）复制子的真核细胞表达质粒，既可在大肠杆菌中传代，也能在允许真核细胞中以染色体外质粒的形式复制和表达外源基因，但不会产生感染性病毒颗粒。对于这种类型的载体进入真核细胞，常用物理（表1-1）和化学的方法（表1-2）。
　　表1-1介导基因转移常用的物理方法
　　物理方法原理材料DNA用量优点缺点
　　传统的针头注射外力注射器高便宜、简单，便于效率比较低应用于临床
　　显微注射细胞内注射DNA显微镜和显微注低适用于细胞水平步骤烦琐，不适用射针的研究，不易降解于临床，专业技术要求高
　　粒子轰击高压气体使微小不同的加速装置低对靶组织有很高需要很多的设备和的载体加速的效率步骤
　　电穿孔电脉冲电穿孔仪低高转染效率未得到广泛认可
　　流体动力学流体动力学的力量特殊的注射器中等简单易于使用、转组织局限性染效率高
　　包裹微球胶囊化的微球包中等控制下投递和释放制备的质量控制裹DNA
　　超声超声仪超声超声仪中等偏低安全、组织损伤小技术不断发展、经验有限
　　表1-2介导基因转移常用的化学方法
　　公司产品组成
　　Amersham-BiosciencesCellPhecttransfectionKitCaPO4orDEAE-DextranBio-RadLabsCytoFecteneTransfectionReagentCationiclipidBDBiosciences-CLOMTECHCLONfectinTMCationiclipid
　　CalPhosTMCalciumphosphateCPGInc.GeneLimoTMTransfectionReagentPlusPolycationiclipids+lipidcompoundGeneLimoTMTransfectionReagentPolycationiclipids+lipidcompoundSuper
　　GeneTherapySystems GenePORTERTMDOPE+ProprietarycompoundsGenePORTERTM2ProprietarymaterialBoosterExpressTMReagentKitProprietarymaterialPGeneGripTMVector/TransfectionGenePORTER+plasmidvector
　　SystemsGlenResearchCytofectinGSCationiclipid
　　续表
　　公司产品组成
　　InvitrogenLipofectAMINE2000TMReagentPolycationiclipid
　　LipofectAMINEPLUSTMReagentPolycationiclipid（DOSPA：DOPE）
　　LipofECTIN.ReagentCationiclipid（DOSPA：DOPE）
　　TransfectionReagentOptimizationSystemLipofectAMINEPLUSTM+Lipofectin.+CellFectin.+DMRIE
　　CellFectin.ReagentCationiclipopolyamine
　　OligofectAMINETMReagentProprietary
　　InvivoGenLipoVecTMCationicphosphonolipids
　　LipoGenTMNon-liposomallipid
　　MBIFermentasExGen500Cationicpolymer
　　ExGen500invivodeliveryagentCationicpolymer
　　NovagenGeneJuiceTMTransfectionReagentProprietarypolyamine
　　PanVeraCorporationTransⅡ.-TKOReagentsPolyamine.
　　TransⅡ.-LT-1andLT-2Polyamine.
　　TransⅡ.ExpressTransfectionReagentPolyamine.
　　TransⅡ.PanPackPolyamine+cationiclipid.
　　TransⅡ.-InsectaCationiclipid.
　　TransⅡ.-293Polyamine.
　　TransⅡ.-KeratinocytePolyamine
　　PromegaTransFASTTMTransfectionReagentCationiclipid
　　TfxTM-10，-20，and-50ReagentsCationiclipid
　　TfxTMReagentsTransfectionTrioCationiclipid
　　Transfectam.ReagentCationiclipid
　　ProFection.MammalianTransfectionDEAE-Destranorcalciumphosphate
　　System
　　QbiogeneGeneSHUTTLETM-20and-40ReagentsPolycationiclipids
　　InvivoGeneSHUTTLETMReagentLiposome-mediatedDOTAP：Chol.
　　DuoFectTMReage

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